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实时的记者和编辑的DNA有效的酶

技术#20170418

通过APOBEC-cas9或裂解DNA编辑实时记者在活细胞cas9

基地的编辑是一个令人兴奋的新基因工程技术。在基因组DNA的c-到叔突变已使用由大鼠APOBEC1单链DNA脱氨酶,cas9切口酶(cas9n),尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)和引导件(克)RNA的核糖络合物实现。在这里,我们报告了APOBEC介导的基础编辑活动的量化的第一个实时报告系统在活哺乳动物细胞。记者表示组成EGFP作为用于转染或转导的标记物,和编辑通过两个grna结合,每个包含一个APOBEC-优选5'tca靶位点的区域的同时处理恢复的上游的mCherry盒的功能。使用这个系统既可以作为附加体和染色体的编辑记者,我们表明,人类APOBEC3A和APOBEC3B基础编辑复合物比原来的老鼠APOBEC1构建更高效。我们也在记者编辑,mCherry的阳性细胞的异源染色体位点展示出编辑事件的重合富集。所述的mCherry记者还量化cas9的双链DNA切割活性,因此可适合与许多不同的CRISPR系统中使用。一种快速,基于荧光的编辑报告系统和更有效的,结构上定义的DNA编辑酶的组合扩大了的基因组编辑和工程技术迅速扩大工具箱的通用性。

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过电流系统的优势:

  • 基于荧光的记者提供了基础的编辑实时定量
  • 记者没有量化成功测序的DNA编辑事件
  • 下一代编辑构建具有最高的效率报道
  • 记者活化能够与异源网站编辑事件细胞的FACS富集(例如,单拷贝染色体基因)
  • 记者让屏幕编辑活动的调节剂
  • 高效的,结构已知编辑酶
  • 13天比标准方法快于“分析测序”的步骤
  • 通过提高评估吞吐量,编辑的效率降低运营成本

应用:

  • 分子生物学研究
  • 基因组工程
  • 生物技术
  • 用于治疗应用的编辑优化
  • 作物工程
  • 动物工程

发展阶段:

体外数据/工作原型。记者和编辑的结构已经建成,并在一系列哺乳动物细胞类型的验证。

引文: ST。马丁,一个。,d。 salamango,A.A。 serebrenik,N。沙班,W.L.棕色,F。多纳蒂,U。 munagala,S.G. conticello,R.S.哈里斯(2018)¬A荧光记者在活细胞定量分析和DNA编辑富集APOBEC-cas9或裂解通过cas9。核酸研究,出版中。